利用IMAPP技術(shù)鑒定活細(xì)胞內(nèi)的蛋白-蛋白相互作用

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      近日，生命中心陳鵬研究組與王初研究組合作在《Nature Communications》雜志上發(fā)表題為“Genetically encoded protein photocrosslinker with a transferable mass spectrometry-identifiable label”的研究論文，報(bào)道了一種基因編碼并具有“質(zhì)譜標(biāo)簽”轉(zhuǎn)移功能的光交聯(lián)探針DiZHSeC?；谠撎结?，作者開發(fā)了一種用于鑒定活細(xì)胞內(nèi)蛋白-蛋白相互作用的新技術(shù)—IMAPP (In-situ cleavage and MS-label transfer After Protein Photocrosslinking)。該技術(shù)在實(shí)現(xiàn)高置信度底物蛋白鑒定的同時(shí)，還能對蛋白-蛋白相互作用的界面進(jìn)行繪制。

       蛋白-蛋白相互作用是支撐生命活動(dòng)的重要基礎(chǔ)，其相互作用網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，在活體條件下開展研究極具挑戰(zhàn)性。近年來，光交聯(lián)技術(shù)，尤其是位點(diǎn)特異性的光交聯(lián)探針與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，已經(jīng)成為活細(xì)胞內(nèi)研究蛋白-蛋白相互作用的有力工具。該技術(shù)通過基因編碼非天然氨基酸將光活性基團(tuán)定點(diǎn)引入蛋白質(zhì)相互作用界面處的特定位點(diǎn)，并利用紫外光照射激活并捕捉“誘餌”蛋白。陳鵬研究組曾于2011年開發(fā)了第一代光交聯(lián)探針DiZPK，并用其鑒定了極酸環(huán)境下大腸桿菌抗酸伴侶蛋白HdeA的“客戶”蛋白(Nat. Chem. Biol, 2011, 7, 671)。然而，第一代光交聯(lián)探針的下游處理步驟采用了傳統(tǒng)的“親和”純化方法，從而不可避免的引入非特異性吸附蛋白和非直接相互作用的蛋白。另一方面，利用DiZPK獲得的交聯(lián)肽段難以通過傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析方法進(jìn)行解析，從而丟失了蛋白質(zhì)相互作用的界面信息。在接下來的研究中，陳鵬研究組于2014年開發(fā)了第二代，可切割的光交聯(lián)探針DiZSeK (J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 11860)。該探針可以在交聯(lián)后實(shí)現(xiàn)底物蛋白與誘餌蛋白的分離，在一定程度上降低了鑒定背景。但該探針仍無法解決交聯(lián)肽段和交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定問題。

      在本研究中，陳鵬與王初兩個(gè)研究組合作開發(fā)了一種具有“質(zhì)譜標(biāo)簽”轉(zhuǎn)移功能的第三代光交聯(lián)探針DiZHSeC。該探針不僅可以實(shí)現(xiàn)交聯(lián)后底物蛋白與誘餌蛋白的分離，還能同時(shí)在底物蛋白上原位產(chǎn)生一個(gè)特異的“質(zhì)譜標(biāo)簽”。通過該“質(zhì)譜標(biāo)簽”，研究者們可以很容易地在質(zhì)譜結(jié)果中區(qū)分底物與非特異性吸附以及非直接相互作用的多肽片段。此外，通過“質(zhì)譜標(biāo)簽”，研究者們可以使用常規(guī)的質(zhì)譜分析軟件對交聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，從而獲得蛋白質(zhì)相互作用界面的信息。他們利用基于DiZHSeC設(shè)計(jì)的IMAPP技術(shù)對HdeA的“客戶”蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定，鑒定的假陽性率從原先的50%降低到了4%。緊接著，他們還利用IMAPP技術(shù)對 HdeA二聚化界面，以及HdeA與HdeA的“客戶”蛋白- DegP的相互作用界面進(jìn)行了繪制。最后，他們還將該技術(shù)拓展至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，研究了小G蛋白R(shí)hoA與其支架蛋白R(shí)TKN的相互作用，鑒定了二者的作用界面。通過上述的應(yīng)用展示，作者期望IMAPP技術(shù)可以被廣泛應(yīng)用于捕捉蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)以及繪制蛋白質(zhì)相互作用界面。這一策略尤其適用于那些利用傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)分析方法難以獲得的相互作用界面，如固有或者條件無序蛋白，以及膜蛋白相互作用的界面。

       陳鵬研究組的11級(jí)博士生楊熠為本文的第一作者。陳鵬和王初為本文的共同通訊作者。該項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部、教育部、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。