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實(shí)驗(yàn)原理

具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)合物。而蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無(wú)關(guān)，該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于1~10mg /mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測(cè)定。

紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為：

試劑和器材

一、試劑

雙縮脲試劑：取1.5g硫酸銅（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6 · 4H2O）溶于500mL蒸餾水中，在攪拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用水稀釋至1000mL。此試劑可長(zhǎng)期保存、備用。

二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

• 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液

10mg/mL結(jié)晶牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

• 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

人血清（稀釋10倍）。測(cè)試其他蛋白質(zhì)樣品應(yīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試范圍內(nèi)。

三、器材

試管1.5×15cm（×16），試管架，移液管1mL（×3）；5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計(jì)。

操作方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取12支試管分成兩組，按下表平行操作：

取兩組測(cè)定的A540值的平均值，即A540為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、樣品測(cè)定

取4支試管分成兩組，按下表平行操作：

三、計(jì)算

取兩組測(cè)定的平均值計(jì)算：

血清樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100mL）=

其中,Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)得濃度（mg/mL），N為稀釋倍數(shù)，V為血清樣品所取的體積（mL），c為樣品原濃度（mg/mL）。

注意事項(xiàng)

（1）須于顯色后30min內(nèi)比色測(cè)定。各管由顯色到比色的時(shí)間應(yīng)盡可能一致。

（3）有大量脂肪性物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混合物，這時(shí)可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測(cè)定。

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