檸檬酸(citric acid, CA)含量測定試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-237014
分光光度法 50管/48樣
注意正式測定之前選擇 2-3 個預期差 大的樣本做預測定
檸檬酸(CA)含量測定意義
CA是生物體內常見的有機酸是重要的食品風味物質。此外CA是羧酸循環(huán)一反應的產物
檸檬酸(CA)含量測定原理
酸性條件，檸檬酸還原 Cr6+生成 Cr3+ 在 545nm 處有特征吸收峰，通過測定 545nm 吸光值的增加，即可計算出樣品中檸檬酸含量。
自備儀器和用品
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水
檸檬酸(CA)含量測定試劑組成和配制
試劑一 液體×1 瓶 4℃保存
試劑二 液體×1 瓶 4℃保存
試劑三 液體×1 支 -20℃保存
試劑四 粉劑×1 瓶 室溫保存 臨用前配制加入 5mL 試劑一 充分溶解
試劑五 液體×1 瓶 4℃避光保存
標準品 液體×1 支 250μmol/L 檸檬酸標準液 4℃保存
檸檬酸(CA)含量測定樣品處理
1. 液體樣品：取 0.1mL 液體 試劑一0.9mL，充分混勻，11000g 4℃離心10min取上清液待測
2. 組織：按照組織質量（g）：提取液體 (mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織加入1mL 試劑一）進行冰浴勻漿 11000g 4℃離心 10min 取上清置冰上待測
3. 線粒體：按照組織質量（g）提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿 600g/min 4℃離心 5min，取上清至另一 EP 管中11000g 4℃離心 10min棄上清（此上清液可用于細胞質 CA 含量測定）向沉淀中試劑二200μl以及試劑三2μl，充分懸浮溶解 11000g 4℃離心 10min，取上清液待測
4. 細菌、真菌中：按照細胞數(shù)量（104個 ）；試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬 胞 入 1mL 試劑一）冰浴超聲波破碎細胞（功率300w 超聲 3秒 間隔 7秒 總時間 3min）11000g 4℃離心 10min，取上清置冰上待測
檸檬酸(CA)含量測定操作
a. 分光光度計預熱 30 min，調節(jié)波長到 545 nm，蒸餾水調零。
b. 試劑一置于 30℃水浴中預熱 30min
c. 空白管：取 EP 管，依次加入 100μL 蒸餾水，700μL試劑一，100μL 試劑四，100μL 試劑五 混勻后室溫靜置 30min，于545nm 測定吸光度 記為 A 空白管
d. 標準管：取 EP 管 依次加入 100μL 標準液，700μL 試劑一，100μL 試劑四，100μL 試劑五，混勻后室溫靜置 30min，于 545nm 測定吸光度 記為 A 標準管
e. 測定管：取 EP 管，依次加入 100μL上清液， 700μL 試劑一 ，100μL 試劑四，100μL 試劑五，充分混勻后室溫靜置 30min，于 545nm 測定吸光度，記為 A 測定管。
注意 空白管和標準管只需測定一次
檸檬酸(CA)含量測定計算公式:
1. 按液體樣本的體積計算
檸檬酸含量（nmol/L）= [C 標準液×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總= 2500×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)
C 標準液：250 μ mol/L=0.25m mol/L；樣品稀釋倍數(shù)(0.1mL樣品+0.9mL試劑一）÷0.1mL 樣本=10；V 總：1.0 mL。
2. 按組織質量計算
檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C 標準液×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)]×V總÷W= 250×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷W
C 標準液：250 μ mol/L；V 總：上清液總體，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質，g。
3.按蛋白含量計算
檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 標準液×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)]÷Cpr= 250×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr
C 標準液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL Cpr：上清液蛋白質含量，mg/mL。
4.按細胞數(shù)量計算
檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 標準液×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)]×V總÷細胞數(shù)量= 250×(A 測定管-A 空白管) ÷(A 標準管-A 空白管) ÷細胞數(shù)量
C 標準液：250 μ mol/L；V 總：上清液總體，1.0 mL=0.001 L；
注意事項
1.樣品處理等過程均需要在冰上進行
2.試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置好的一周內使用完
3.試劑五為易致癌物質，實驗過程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚
4.檸檬酸提取液不能用于蛋白含 測定 如需測定蛋白含 需另取組織使用本公司BCA 試劑盒（貨號：QYS-237014）進行測定
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