α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-234099
分光光度法 50管/48樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
α-葡萄糖苷酶活性檢測測定意義：
α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細胞識別和一些信號分子產(chǎn)生密切相關(guān)。
測定原理：
α-葡萄糖苷酶分解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算 α-GC 活性。
自備用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 10mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
α-葡萄糖苷酶活性檢測測定步驟：
1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 400 |
|
試劑二 | 500 | 500 |
樣本 | 100 | 100 |
充分混勻，放入 37℃準確水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）
試劑一 |
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| 400 |
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| 充分混勻，8000g，4℃，離心 5min，取上清液 |
|
上清液 |
| 500 |
| 500 |
試劑三 |
| 1000 |
| 1000 |
充分混勻，室溫靜置 2min 后， 400nm 處測定吸光值 A，計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。
α-葡萄糖苷酶活性檢測計算：
標(biāo)準條件下測定的回歸方程為 y =0.00543x -0.0027；x 為標(biāo)準品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-GC 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測定建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（貨號：QYS-237014）。
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-GC 活力(nmol/min /g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-GC 活力(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.123×(ΔA +0.0027)
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，30min。
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