谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-23073
分光光度法 50管/48樣
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性測定意義：
glutathione S-transferase是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族，主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)。GST 是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與 GSH 的巰基共價結(jié)合，使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì)，易于從膽汁或尿液中排泄，達到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此，GST 在保護細胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外，因為 GST 具有 GSH-Px 活性，亦稱為 non-Se GSH-Px，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如 DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意，GST 催化的反應(yīng)減少 GSH 含量，但是不增加GSSG 含量。
谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性測定原理：
glutathione S-transferase 催化 GSH 與 CDNB 結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為 340nm；通過測定 340nm 波長處吸光度上升速率，即可計算出 GST 活性。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5 mL 蒸餾水溶解。
粗酶液提?。?/font>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，用蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三放在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）保溫。
3. 空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 試劑一，900μL 試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 340nm 測定吸光度變化，記錄 10 s 和 310 s 吸光度為 A1 和 A2。
4. 測定管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 上清液，900μL 試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 340nm 測定吸光度變化，記錄 10 s 和 310 s 吸光度為 A3 和 A4。
注意：空白管只需測定一次。
谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為1 個酶活單位。
GST（nmol/min/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T =230×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為 1個酶活單位。
GST（nmol/min/g 鮮重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =230×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 104 個細胞每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為 1 個酶活單位。
GST（nmol/min/104 cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V 反總÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T =230×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為1 個酶活單位。
GST（nmol/min/mL）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V 反總÷V 樣÷T = 230×[(A4－A3)－(A2-A1)]
ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103 L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；106：1mol=1×106μmol；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1100μL=0.0011 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（貨號：QYS-237014）；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間（min），5min。
注意事項：
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；
2. 細胞中 GST 活性測定時，細胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細胞中 GST 的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；
3. 本法測定 GST 活性的線性范圍可達 76 μmol/min /L，測定前先用 1～2 個樣做預(yù)實驗，如5min 內(nèi)反應(yīng)不成線性，須對樣品用蒸餾水稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；
4. 測定反映的溫度對測定結(jié)果有影響，請控制在 25℃或者 37℃（哺乳動物）。
返回
微博|
手機
