L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，Gal LDH）活性測定試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-231093
可見分光光度法：50 管/48 樣
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定意義：
L-半乳糖途徑是合成 AsA 的主要途徑。Gal LDH 位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi) AsA生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對植物體內(nèi) AsA 含量的積累起著至關(guān)重要的作用。
L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定原理：
Gal LDH 催化 L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素 c（Cyt c），還原型 Cyt c 在 550nm 有吸收峰；測定還原型 Cyt c 增加速率，來計算 Gal LDH 活性。
自備儀器和用品：
臺式離心機(jī)、可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 40mL 蒸餾水，充分溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水，充分溶解。
粗酶液提?。?/font>
按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 550nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。
3. 依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 550nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2，△A = A2﹣A1。
L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性 活性計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
Gal LDH 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原 1μmol Cyt c 為 1 個酶活單位。
Gal LDH (μmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×106÷（Cpr×V 樣）÷T=289×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
Gal LDH 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原 1μmol Cyt c為 1 個酶活單位。
Gal LDH (μmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×106÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T =289×△A ÷W
ε：還原型 Cyt c 摩爾消光系數(shù)，17.3×103L/ mol/cm；d：比色皿光徑(cm)，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；106：1mol=1×106μmol；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒（貨號：QYS-237014）；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2min。
注意事項:
試劑二和試劑三配制好后 3 天內(nèi)使用完。
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