NADP-蘋果酸酶（Malic enzyme，NADP-ME）試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號(hào)：QYS-231051
分光光度法：50 管/48樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測
NADP-蘋果酸酶活性測定意義：
蘋果酸酶廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和 CO2，以及伴隨 NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物 ME 活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將 ME 分為 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。
NADP-蘋果酸酶活性測定原理：
NADP-蘋果酸酶催化 NADP+還原成 NADPH，在 340nm 下測定 NADPH 增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。；
試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 支，4℃保存；用時(shí)加 2mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)加 1mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
NADP-蘋果酸酶樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
NADP-蘋果酸酶活性測定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑一、二、三和四置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。如果一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上（混合液現(xiàn)配現(xiàn)用）。
3、 操作表：
| 試劑名稱（μL） |
| 測定管 |
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| 試劑一 |
| 600 |
| 試劑二 |
| 225 |
| 試劑三 |
| 30 |
| 試劑四 |
| 15 |
| 樣本 |
| 30 |
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將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，混勻，立即記錄 340 nm 波長下初始吸光度 A1 和反應(yīng) 1min 后的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。
注意：如果 ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長到 2 分鐘或 5 分鐘。
NADP-蘋果酸酶活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度，建議選用本公司的 BCA 法蛋白含量測定試劑盒（貨號(hào)：QYS-237014）。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T = 4823×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =9.646×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，9×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
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