硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxin reductase, TrxR）試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號(hào)：QYS-231065
分光光度法 50管/48樣
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
硫氧還蛋白氧化還原酶活性測(cè)定意義：
硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR是一種 NADPH 依賴的包含 FAD 結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及 NADPH 共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR 與 GR 活性類似，催化 GSSG 還原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。
硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR活性測(cè)定原理：
硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR催化 NADPH 還原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通過測(cè)定 412nm 波長處 TNB 的增加速率，即可計(jì)算 TrxR 活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5 mL 蒸餾水溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5 mL 蒸餾水溶解。
粗酶液提?。?/font>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR活性 測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 412nm，用蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱 30min。
3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 試劑二，100μL 試劑三，800μL 試劑一，迅速混勻后于 412 nm 測(cè)定 10 s 和 310 s 吸光度，記為 A1 和 A2?！鰽 空白管=A2-A1。
4. 測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 試劑二，100μL 試劑三，700μL 試劑一，100μL上清液，迅速混勻后于 412 nm 測(cè)定 10 s 和 310 s 吸光度，記為 A3 和 A4。△A 測(cè)定管=A4-A3。
注意：空白管只需測(cè)定一次。
硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR活性計(jì)算公式：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。
TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T = 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。
TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T = 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。
TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。
TrxR（nmol/min /mL）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T = 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）
ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：QYS-237014）； V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），100μL=0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。
硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR活性試劑盒注意事項(xiàng):
1. 測(cè)定前須先取 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，使得吸光值在 5min 內(nèi)程線性變化。哺乳動(dòng)物組織及血液制品 TrxR 活力測(cè)定時(shí)，一般須用蒸餾水稀釋 5 倍左右；測(cè)定過程操作須迅速。
2. 試劑二和試劑三配制好后 3 天內(nèi)使用完。
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