脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量測定試劑盒說明書
發(fā)布時間：2017-08-11 17：10：00 出處：齊一生物技術(shù)部 作者：測定試劑盒
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-232001
紫外分光光度法：50 管/48 樣
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
脫氫抗壞血酸含量測定意義：
AsA 作為植物細胞一個重要生理指標，其 AsA 的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對一系列環(huán)境脅迫的響應。DHA 是 AsA 的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。
脫氫抗壞血酸含量測定原理：
DTT 還原 DHA 生成 AsA，通過測定體系中 AsA 的生成速率，即可計算出 DHA 含量。
自備儀器和用品：
低溫離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體 50 mL×1 瓶，室溫保存。
試劑二：液體 40 mL×1 瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10mL 蒸餾水充分溶解。
標準品：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用前加入 5.743 mL 蒸餾水充分溶解；吸取 0.1 mL 上述溶液，加入 0.9 mL 蒸餾水，混勻，即為 100μmol/L DHA。
樣品中 DHA 提?。?/font>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；12000g，4℃離心 10min，取上清液置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
脫氫抗壞血酸含量DHA 測定操作：
1. 分光光度計預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 265 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。
3. 標準管：依次在 1mL 石英比色皿加入 100μL 標準液、800μL 預熱的試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2，△A 空白管=A2-A1。
4. 測定管：依次在 1mL 石英比色皿加入 100μL 上清液、800μL 預熱的試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值 A3 和 A4，△A 測定管=A4-A3。
注意：標準管只需測定一次。
計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
DHA(nmol/mg prot) =[C 標準液×△A 測定管÷△A 標準管×V 標準]÷（Cpr×V 樣） =100×△A 測定管÷△A 標準管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
DHA(nmol/g 鮮重) =[C 標準液×△A 測定管÷△A 標準管×V 標準]÷(W×V 樣÷V 樣總) =100×△A 測定管÷△A 標準管÷W
(3). 按細胞數(shù)量計算
DHA(nmol/104 cell) =[C 標準液×△A 測定管÷△A 標準管×V 標準]÷(W×V 樣÷V 樣總) =100×△A 測定管÷△A 標準管÷細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
DHA(nmol/mL) =[C 標準液×△A 測定管÷△A 標準管×V 標準]÷V 樣=100×△A 測定管÷△A 標準管
C 標準液：100μmol/L；V 標準：加入反應體系中標準液體積，0.1mL；V 樣總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；V 樣：加入反應體系中上清液體積，0.1mL；W：樣品質(zhì)量，g。
脫氫抗壞血酸含量測定注意事項：
1. 臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。
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