一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號(hào)：QYS-232079
分光光度法：50 管/24樣
正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
一氧化氮（NO）含量測(cè)定意義
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。
一氧化氮（NO）含量測(cè)定原理
NO 在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2—，在酸性條件下，NO2—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在 550nm 處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算 NO 含量。為了排除樣品色素等的影響，每個(gè)樣品需做對(duì)照管。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、蒸餾水。
試劑組成和配制
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 12mL×1 瓶，4℃避光保存。
樣品處理
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測(cè)定。
一氧化氮（NO）含量測(cè)定步驟和操作表
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
樣品（μL） | 400 | 400 |
試劑一（μL） |
| 250 |
試劑二（μL） | 250 |
|
試劑三（μL） | 250 | 250 |
混勻，4℃靜置 15min，以對(duì)照管調(diào)零，1mL 玻璃比色皿，測(cè)定 A550。
一氧化氮（NO）含量計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103，R2= 0. 9986
1、組織樣品：
NO 含量定義：25℃時(shí)，每克樣品或每毫克蛋白 15min 生成 1μmoL NO2— ，相當(dāng)于 1μmoL NO。
（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算
NO 含量（μmoL/g 鮮重）=（A550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10-3 = 0.14×（A550 +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO 含量（μmoL/mg prot）=（A550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10-3 = 0.14×（A550 +0.0103）÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度建議選用本公司的 BCA 法蛋白含量測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：QYS-237014）
2、其他樣品：
NO 含量定義：25℃時(shí)，每升樣品 15min 生成 1μmoL NO2— ，相當(dāng)于 1μmoL NO。
NO 含量（μmoL/L）=（A550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣 = 140×（A550 +0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.9mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.4mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
一氧化氮含量檢測(cè)注意事項(xiàng)
1. 試劑盒 2-8℃保存。
2. 盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)，試劑三有腐蝕性，操作時(shí)請(qǐng)做好防護(hù)措施。
3. 若檢測(cè)出得 OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外，請(qǐng)將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋，并在計(jì)算公式中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。
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