β-木糖苷（β- xylosidase）測(cè)定試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號(hào)：QYS-235016
分光光度法 50管/24樣
正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定
β-木糖苷活性測(cè)定意義
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵、另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值
β-木糖苷活性測(cè)定原理
β-木糖苷酶催化對(duì)硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在 405nm 處有特征吸收峰，測(cè)定 405nm 光吸收增加速率，可計(jì)算β-木糖苷 活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、溫離心機(jī)、可見分光光度、1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存
試劑一：液體 2mL×1 瓶，4℃避光保存
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存
試劑三：液體 20mL×1 瓶，4℃保存
粗酶液提取
1.組織：按照組織質(zhì)量（g） 提取液體 (mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組 ，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 20min，取上清待測(cè)
2.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3.液體：直接檢測(cè)。
β-木糖苷活性測(cè)定操作表
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
酶液 （μL） | 200 | 200 |
試劑一 （μL） |
| 50 |
試劑二 （μL） | 400 | 350 |
混勻，45℃水浴 20min |
試劑三 （μL） | 400 | 400 |
混勻，靜置 5min， 1mL 玻璃比色皿，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定 A405 |
β-木糖苷酶活性計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=3.34x-0.001，R2=0.9991
1、按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每毫克蛋白質(zhì) 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位
β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot） | = | A405 | + | 0.001 | × | V 反總 | ÷ | （V 樣×Cpr） | ÷T×1000 |
3.34 | × | 138 |
= 542.4×(A405+0.001)÷ Cpr
2、按樣本重量計(jì)算
酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每克樣品 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。
β-木糖苷酶活性（nmol/min/ 鮮重 ） | = | A405 | + | 0.001 | × | V 反總 | ÷ | （V 樣×W） | ÷T×1000 |
3.34 | × | 138 |
= 542.4×(A405+0.001)÷W
3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：
酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每104 個(gè)細(xì)胞 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。
β-木糖苷酶活性（nmol/min/ 104cell） | = | A405 | + | 0.001 | × | V 反總 | ÷ | V 樣×V 樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)） | ÷T×1000 |
3.34 | × | 138 |
= 542.4×(A405+0.001)÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）
4、按液體體積計(jì)算
酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每毫升液體 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。
β-木糖苷酶活性（nmol/min/ ml） | = | A405 | + | 0.001 | × | V 反總 | ÷ | V 樣×V 樣總 | ÷T×1000 |
3.34 | × | 138 |
= 542.4×(A405+0.001)
V 樣總：加入提取液體 ，1mL；V 反總：反應(yīng)總體 ，1mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；138：對(duì)硝基苯酚分子量：Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì) ，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；1000:1mmol/L=1000μmol/L
注意事項(xiàng)
1、吸光度變化應(yīng)該控制在 0.01~0.8 之間 否則 大樣品 或稀釋樣品，注意 算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變
2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定，可選用 BCA 法測(cè)定蛋白含量試劑盒進(jìn)行測(cè)定
注：系統(tǒng)試劑盒說明書僅供參考、具體請(qǐng)參考試劑盒紙質(zhì)版說明書。
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