中科院生化與細(xì)胞所李勁松研究組和第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院袁文課題組，結(jié)合 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)和半克隆技術(shù)，實現(xiàn)了點突變小鼠的高效制備。相關(guān)成果日前在線發(fā)表于《遺傳學(xué)報》。

建立點突變小鼠模型，尤其是致病基因點突變的小鼠模型，對研究基因的功能和疾病的致病機制至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)的同源重組編輯胚胎干細(xì)胞的方法耗時耗力。通過 CRISPR-Cas9 直接注射受精卵可獲得攜帶點突變的小鼠，但這種方法產(chǎn)生攜帶點突變小鼠的效率不高且存在個體基因型嵌合的現(xiàn)象。

李勁松研究組的前期研究建立了小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞及將其注入卵子獲得健康小鼠的半克隆技術(shù)，并進一步優(yōu)化該技術(shù)獲得了能穩(wěn)定高效產(chǎn)生半克隆小鼠的單倍體干細(xì)胞，從而為快速制備攜帶目的點突變小鼠模型提供了新方法。

此次研究人員采用攜帶點突變的單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN）作為修復(fù)模板與 CRISPR-Cas9 共同轉(zhuǎn)入單倍體細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)隨著目的突變位點與 Cas9 酶切割位點距離的增加，同源重組獲得攜帶突變位點細(xì)胞的效率急劇下降。當(dāng)距離≥10bp 時，采用 ssODN 為模板的效率低至無法檢測，無法獲得攜帶這些位點的突變細(xì)胞。為此，研究組構(gòu)建了攜帶點突變的雙鏈載體作為模板（長度為 258bp～2.1kb），發(fā)現(xiàn)可顯著提高同源重組效率。同時，當(dāng)載體長度在 1～1.5kb 時，同源重組效率高。研究人員進而建立了攜帶點突變的單倍體細(xì)胞系，并通過卵子注射高效獲得攜帶目的點突變的小鼠模型。