在歐美國(guó)家，染色體基因組芯片分析(CMA)目前已成為一項(xiàng)常規(guī)的臨床遺傳學(xué)診斷工具。近幾年我國(guó)CMA的臨床應(yīng)用在逐步推廣，為眾多遺傳病患者提供了精確分子診斷。值得注意的是，由于此項(xiàng)技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜的臨床檢測(cè)項(xiàng)目，涉及臨床適用指征、芯片要求、實(shí)驗(yàn)流程和質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、芯片結(jié)果驗(yàn)證、臨床相關(guān)性解釋、患者遺傳咨詢(xún)及轉(zhuǎn)化研究等許多重要環(huán)節(jié)，我國(guó)CMA的臨床應(yīng)用存在諸多不規(guī)范行為，因此中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分會(huì)、中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)青春期醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)臨床遺傳學(xué)組、中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)內(nèi)分泌遺傳代謝學(xué)組組織專(zhuān)家，對(duì)CMA技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)展開(kāi)交流討論，形成了專(zhuān)家共識(shí)，對(duì)該技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)行規(guī)范指導(dǎo)，以期更好地發(fā)揮CMA在兒科遺傳病的臨床檢測(cè)效果，提高技術(shù)操作及數(shù)據(jù)分析的科學(xué)性、準(zhǔn)確性、可靠性，為更多地實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展CMA臨床檢測(cè)提供指導(dǎo)和依據(jù)。另外，特別建議通過(guò)專(zhuān)家共識(shí)建立公共數(shù)據(jù)分享平臺(tái)，可更好地了解中國(guó)人群基因組失衡和臨床表型之間的關(guān)系，為CMA檢測(cè)結(jié)果的臨床解釋提供更為可靠的依據(jù)。

基因芯片種類(lèi)及原理

基于設(shè)計(jì)原理的不同，基因芯片主要有兩大平臺(tái)。一種是比較基因組雜交芯片(aCGH)，其基本原理是將待測(cè)樣本DNA與正常對(duì)照樣本DNA分別用不同的熒光標(biāo)記，通過(guò)與芯片上固定探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性雜交獲得定量的拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果；另外一種是單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(SNP array)，其基本原理是將探針連接在微珠上，然后將攜帶探針的微珠隨機(jī)黏附在芯片上，待測(cè)樣本DNA和探針進(jìn)行雜交及單堿基延伸，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)掃描，分析待測(cè)樣本CNV及基因型，該平臺(tái)在分析患者的基因組時(shí)不需要正常對(duì)照樣本。通過(guò)aCGH技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢出CNV，而SNP array除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測(cè)出大多數(shù)的單親二倍體(UPD)和一定比例的嵌合體。近年來(lái)，兩大平臺(tái)技術(shù)不斷改進(jìn)，同時(shí)涵蓋CNV和SNP的芯片具備雙重優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)的敏感性、特異性、可靠性等方面有了很大改善。

CMA在兒童遺傳病診斷中的臨床推薦指征

1. 推薦指征：

對(duì)以下臨床表型的疾病，建議將CMA作為一線(xiàn)檢測(cè)手段：(1)不明原因的智力落后和(或)發(fā)育遲緩。(2)非已知綜合征的多發(fā)畸形。(3)自閉癥譜系障礙。

國(guó)內(nèi)外也有臨床研究支持將身材矮小、肥胖、語(yǔ)言發(fā)育延遲、癲癇及其他精神神經(jīng)發(fā)育障礙等作為CMA的應(yīng)用指征。對(duì)此我們需要進(jìn)一步積累臨床數(shù)據(jù)，以制定相應(yīng)的指南。

當(dāng)某種疾病或綜合征根據(jù)臨床評(píng)估可能為單和(或)多基因點(diǎn)突變?yōu)橹鞯募膊r(shí)，CMA不應(yīng)作為首選檢測(cè)方法。

2. CMA檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)：

(1)可在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種染色體不平衡導(dǎo)致的遺傳病。(2)可同時(shí)檢測(cè)染色體缺失和重復(fù)，且能比較準(zhǔn)確、客觀地界定CNV(區(qū)間及大小)，而不像核型分析那樣依賴(lài)對(duì)區(qū)帶強(qiáng)度的主觀觀察和判斷。(3)利用SNP array探針平臺(tái)可同時(shí)檢測(cè)雜合性缺失和>10%比例的嵌合體。(4)與核型分析相比，CMA檢測(cè)不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分辨率高出近千倍，幾乎可用于任何組織的DNA分析。

3. CMA檢測(cè)的局限性：

(1)不能檢測(cè)染色體平衡易位、倒位及復(fù)雜性重排。(2)不能檢測(cè)出點(diǎn)突變和小片段插入。(3)不能檢測(cè)出低比例嵌合體(<10%)。(4)可能檢出臨床意義不明的CNV。

需要說(shuō)明的是，沒(méi)有一種芯片平臺(tái)可檢出某種綜合征的所有相關(guān)突變，也無(wú)法檢出芯片探針未覆蓋的區(qū)域的CNV，且目前CMA技術(shù)不能檢測(cè)低于探針覆蓋和檢測(cè)能力以下的重復(fù)和缺失、基因表達(dá)異常和甲基化異常。

4. 可能的陽(yáng)性率：

CMA的檢測(cè)陽(yáng)性率與疾病應(yīng)用指征、疾病種類(lèi)和芯片類(lèi)型有關(guān)。

本多中心臨床研究前期的數(shù)據(jù)表明：針對(duì)智力落后和(或)發(fā)育遲緩疾病患者，陽(yáng)性率約為19.2%，針對(duì)多發(fā)畸形疾患陽(yáng)性率約32.6%。此結(jié)果與國(guó)外的數(shù)據(jù)基本一致(13%～20%)。

CMA實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程及質(zhì)量控制

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

(1) 臨床應(yīng)用芯片的基本參數(shù)要求：

①芯片探針應(yīng)涵蓋復(fù)發(fā)性基因組病及常見(jiàn)微缺失/微重復(fù)綜合征區(qū)域，并覆蓋亞端粒區(qū)域；②全基因組的芯片(非靶向芯片)應(yīng)可以檢出>400 kb的CNV；③芯片探針應(yīng)包括能檢出已知印跡區(qū)域的純合區(qū)(AOH),及能評(píng)估血緣關(guān)系水平的全基因組SNP探針；④分辨率并非越高越好，需結(jié)合臨床設(shè)計(jì)合適的芯片；⑤對(duì)已知致病性基因，在全基因組檢測(cè)中需要針對(duì)這些基因增加探針密度以提高診斷的敏感性和準(zhǔn)確性；⑥針對(duì)重復(fù)序列，良性的拷貝數(shù)多態(tài)位點(diǎn)和(或)會(huì)呈現(xiàn)假陽(yáng)性重復(fù)或缺失導(dǎo)致不能真實(shí)反映樣本CNV的區(qū)域，可不設(shè)計(jì)芯片探針。

(2) 芯片結(jié)果的臨床驗(yàn)證：

對(duì)全基因組CMA檢測(cè)的臨床驗(yàn)證應(yīng)有別于對(duì)單基因病或特定綜合征的檢測(cè)方法，要求驗(yàn)證每一探針的性能是不現(xiàn)實(shí)的，也沒(méi)有必要。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所選擇的芯片平臺(tái)，界定平臺(tái)特異性檢測(cè)最小變異(CNV，AOH)的能力，進(jìn)而用攜帶有大于最小變異的陽(yáng)性樣本進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用規(guī)范的操作流程，以證明平臺(tái)檢測(cè)CNV及AOH的敏感性、特異性及可重復(fù)性。

(3) 受檢樣本的準(zhǔn)備：

CMA檢測(cè)的基因組DNA標(biāo)本來(lái)源包括外周血、組織、唾液或口腔黏膜拭子等。不同的組織來(lái)源應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)幕蚪MDNA提取方法并適合不同芯片平臺(tái)對(duì)濃度和純度的要求。

2. 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制：

(1)芯片流程質(zhì)量控制：根據(jù)平臺(tái)要求不同，芯片流程質(zhì)量控制的原則是符合平臺(tái)特異性的QC參數(shù)。(2)軟件分析：利用與平臺(tái)配套的軟件，通過(guò)前期驗(yàn)證制定合適的軟件分析參數(shù)設(shè)置。軟件的版本及設(shè)置需要在實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制報(bào)告中明確顯示，以便查詢(xún)或重新分析數(shù)據(jù)時(shí)參考。

分析及解讀報(bào)告原則

1. CNV的解讀原則：

(1)考慮基因組失衡區(qū)間的大小。從原則上講，基因組失衡的區(qū)間越大，越可能有臨床意義。但人類(lèi)基因組中也有一些大于1 Mb的非致病性失衡；一些很小的CNV涉及關(guān)鍵基因或關(guān)鍵基因的一部分，也可能為致病性失衡。(2)考慮所包含及鄰近的基因及數(shù)目。從原則上講，失衡區(qū)域包含的基因越多，越可能有臨床意義。但包含基因的功能及致病性更為重要。在基因組中已經(jīng)揭示一些非編碼區(qū)域有重要的調(diào)控元件，也可能有重要的臨床意義。(3)與數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行比較。如：DECIPHER(https：//decipher.sanger.ac.uk/)、DGV(http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、ClinVar(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)和統(tǒng)一的中國(guó)人群CNV數(shù)據(jù)庫(kù)等。正常人群中出現(xiàn)類(lèi)似的CNV變異越多，顯示其臨床意義良性的可能性就越大，但并不是在正常人群中出現(xiàn)過(guò)的變異就一定沒(méi)有臨床意義。(4)一般缺失比重復(fù)更有臨床意義?；蚪M中也有一些三倍劑量敏感基因具有肯定的致病性。(5)新發(fā)(de novo)變異比父母?jìng)鬟f下來(lái)(inherited)的變異更可能具有致病性。但從正常父母?jìng)鬟f下來(lái)的變異不一定沒(méi)有臨床意義；從患病的父母一方傳遞下來(lái)的變異也不一定致病，需要根據(jù)變異區(qū)域的劑量、大小、基因及數(shù)據(jù)庫(kù)資料綜合分析。

2. CNV分類(lèi)：

依據(jù)ACMG指南，建議將CNV分成三大類(lèi)5級(jí)，分類(lèi)的基本原則如下：(1)致病性CNV：一段缺失或重復(fù)與一個(gè)已報(bào)道的微缺失/微重復(fù)綜合征致病區(qū)域在位置和大小上匹配，或缺失中包含因單倍劑量不足而致病的基因或基因的一部分，或重復(fù)中包含三倍劑量敏感基因的全部(有關(guān)單倍劑量不足和三倍劑量敏感基因可查詢(xún)ClinGen網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen/。另外涉及多個(gè)基因的大片段缺失(通常遠(yuǎn)大于1 Mb)或重復(fù)也為致病性，特別是新發(fā)變異。因不完全外顯、表現(xiàn)多樣等原因，相同致病類(lèi)CNV并不一定導(dǎo)致相同的臨床表型。(2)可能致病性CNV(90%致病可能)：一段缺失或重復(fù)與一個(gè)已報(bào)道的致病性缺失或重復(fù)有部分重疊，或涉及可疑但并未在疾病致病機(jī)制中證實(shí)的基因，或涉及的基因雖有支持單倍劑量不足或三倍劑量敏感的證據(jù)，但不足以得出肯定結(jié)論。(3)臨床意義不明性CNV(VUS):此類(lèi)變異不符合致病條件也不符合良性條件，文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)論尚未一致，暫沒(méi)有足夠的證據(jù)做肯定的分類(lèi)。(4)可能良性CNV：含有基因的變異在正常人群中多次發(fā)生，但發(fā)生率未達(dá)1%。(5)良性CNV：涉及的CNV在DGV數(shù)據(jù)庫(kù)或內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)中的發(fā)生率>1%;或該CNV已在多個(gè)同行審議的出版物或經(jīng)審校的數(shù)據(jù)庫(kù)(如ClinVar)中報(bào)告為良性；或正常人群中有發(fā)生，但不到1%的發(fā)生率，CNV不包含任何基因或重要的基因組成部分。

3. AOH的解讀原則：

AOH大致有3種起因：(1)血源同一(IBD):這是由于父母是遠(yuǎn)親關(guān)系。在基因組中表現(xiàn)為小的AOH分散在少數(shù)幾條染色體上面。(2)近親關(guān)系：這是由于父母親緣關(guān)系較近。在基因組中表現(xiàn)為許多染色體上有較大的AOH片段，純合區(qū)總和在基因組中所占比例可以反映親緣關(guān)系的程度：25%左右的比例提示一級(jí)親緣關(guān)系，12.5%左右的比例提示二級(jí)親緣關(guān)系，6.25%左右的比例提示三級(jí)親緣關(guān)系。雖然這些AOH本身不致病，但會(huì)增加隱性遺傳病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于近親關(guān)系也需要做好檢測(cè)前后的咨詢(xún)。(3)單親二倍體(UPD)：這是一類(lèi)特殊的遺傳現(xiàn)象，是指某一染色體的兩個(gè)拷貝均來(lái)源于父親或母親。包含異單親二倍體和等單親二倍體兩種情況。CMA只能檢測(cè)出等單親二倍體。由UPD引起的AOH一般只發(fā)生在一條染色體上面，有時(shí)整條染色體表現(xiàn)為AOH，有時(shí)因異單親二倍體和等單親二倍體發(fā)生在同一染色體上，AOH表現(xiàn)為區(qū)域性(segmental UPD)。已知第6、7、11、14、15及20號(hào)染色體有印跡致病基因，當(dāng)AOH發(fā)生在這幾條中的一條染色體(較大可能性為UPD)時(shí)，該AOH可分類(lèi)為可能致病，需進(jìn)一步證實(shí)是UPD，并結(jié)合臨床表征進(jìn)行分析。

對(duì)于報(bào)告AOH，除了第三類(lèi)AOH中提到的發(fā)生在第6、7、11、14、15及20號(hào)染色體上的AOH歸屬可能致病外，其他AOH臨床意義均不明確，應(yīng)結(jié)合臨床表型，尋找隱性致病基因外顯的可能。

遺傳咨詢(xún)

1. 檢測(cè)前遺傳咨詢(xún)：

臨床醫(yī)生在開(kāi)具CMA檢查前，應(yīng)對(duì)監(jiān)護(hù)人詳細(xì)告知檢測(cè)方法、芯片類(lèi)型、可檢測(cè)的疾病、可能出現(xiàn)的檢測(cè)結(jié)果。

2. 針對(duì)檢測(cè)報(bào)告的遺傳咨詢(xún)：

臨床醫(yī)生需針對(duì)報(bào)告結(jié)果給家屬提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢(xún)：(1)基因型與表型的關(guān)系，疾病的遺傳方式：將已報(bào)道的攜帶類(lèi)似CNV的患者主要表型與先證者進(jìn)行對(duì)比，了解基因型與表型的關(guān)系；從CNV的來(lái)源，以及數(shù)據(jù)庫(kù)等綜合信息判斷，解釋先證者CNV的類(lèi)型。(2)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)以及其子代的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：根據(jù)CNV是否來(lái)自父母，或源于父母的染色體平衡易位，評(píng)估再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)CNV的類(lèi)型，評(píng)估先證者子代的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。(3)疾病的自然進(jìn)程以及必要的預(yù)防性措施：對(duì)已報(bào)道的類(lèi)似CNV攜帶者文獻(xiàn)進(jìn)行回顧，將此類(lèi)患者的疾病進(jìn)程，可能出現(xiàn)的疾病風(fēng)險(xiǎn)，以及應(yīng)采取的預(yù)防措施告知監(jiān)護(hù)人。(4)產(chǎn)前診斷的方法：對(duì)已知的致病性CNV，告知可通過(guò)何種方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷及不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)。(5)先證者確診對(duì)家族中其他成員的影響，是否有必要對(duì)家族中其他成員進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，為家族中可能的攜帶者進(jìn)行遺傳咨詢(xún)和必要的遺傳學(xué)檢測(cè)。

齊一生物小編